La ricerca di molecole bioattive negli alimenti rappresenta una delle frontiere più promettenti della nutrizione funzionale, ma la complessità chimica di matrici come il caffè tostato ha sempre posto sfide metodologiche considerevoli. Un gruppo di ricercatori del Kunming Institute of Botany, parte dell'Accademia Cinese delle Scienze, ha ora sviluppato una strategia analitica integrata che combina spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem e analisi di reti molecolari per identificare composti precedentemente sconosciuti nei chicchi di Coffea arabica tostati. Il risultato, pubblicato sulla rivista Beverage Plant Research sotto la guida di Minghua Qiu, ha portato alla scoperta di sei nuovi esteri diterpenici con proprietà inibitorie sull'α-glucosidasi superiori a quelle dell'acarbosio, farmaco di riferimento per il controllo glicemico.
L'α-glucosidase è un enzima chiave nel metabolismo dei carboidrati: situato nell'orletto a spazzola dell'intestino tenue, catalizza la scissione finale dei polisaccaridi in monosaccaridi assorbibili, determinando così la velocità con cui il glucosio entra nel circolo ematico dopo un pasto. Inibire questo enzima significa rallentare l'assorbimento degli zuccheri e ridurre i picchi glicemici postprandiali, meccanismo d'azione alla base di farmaci utilizzati nella gestione del diabete di tipo 2. La scoperta di inibitori naturali potenti diventa quindi rilevante non solo dal punto di vista della comprensione biochimica, ma anche per lo sviluppo di alimenti funzionali o nutraceutici destinati a popolazioni a rischio metabolico.
Il protocollo messo a punto dal team cinese si articola in tre fasi successive, progettate per massimizzare l'efficienza analitica riducendo l'uso di solventi. Inizialmente, l'estratto grezzo di diterpeni è stato frazionato mediante cromatografia su gel di silice in 19 frazioni distinte. Ciascuna frazione è stata quindi caratterizzata tramite spettroscopia NMR del protone e sottoposta a test di inibizione enzimatica. L'applicazione di analisi cluster a heatmap ai dati NMR ha permesso di identificare le frazioni Fr.9-Fr.13 come quelle più promettenti, sulla base di pattern distintivi di segnali protonici correlati all'attività biologica.
L'analisi approfondita della frazione Fr.9 mediante spettroscopia NMR al carbonio-13 con tecnica DEPT ha rivelato la presenza di un gruppo funzionale aldeidico, confermando ipotesi preliminari sulla struttura molecolare. Dopo purificazione tramite cromatografia liquida ad alte prestazioni in modalità semi-preparativa, sono stati isolati tre esteri diterpenici mai descritti in precedenza, denominati caffaldeidi A, B e C. La determinazione strutturale completa è stata ottenuta combinando spettroscopia NMR monodimensionale e bidimensionale con spettrometria di massa ad alta risoluzione mediante ionizzazione elettrospray.
Le tre molecole differiscono per la catena acilica esterificata allo scheletro diterpenico: la caffaldeiде A contiene acido palmitico (16 atomi di carbonio), la B acido stearico (18 carboni) e la C acido arachidico (20 carboni). Nonostante queste differenze strutturali, tutte e tre hanno dimostrato una potente attività inibitoria sull'α-glucosidasi in saggi in vitro, con una correlazione interessante tra lunghezza della catena e potenza inibitoria: la caffaldeiде C, con la catena più lunga, ha mostrato l'attività maggiore.
Per identificare composti in tracce che sfuggono alle analisi NMR e cromatografiche convenzionali a causa delle loro concentrazioni estremamente basse, i ricercatori hanno applicato una strategia complementare basata su LC-MS/MS a gruppi di frazioni combinati. I dati di frammentazione sono stati elaborati attraverso la piattaforma GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) e visualizzati con il software Cytoscape per costruire reti molecolari che mettono in relazione composti con pattern di frammentazione simili. Questo approccio computazionale ha rivelato l'esistenza di altri tre esteri diterpenici precedentemente sconosciuti, strutturalmente correlati alle caffaldeidi ma contenenti acidi grassi diversi: acido margarico, acido ottadecenoico e acido nonadecanico. La verifica nei database di riferimento ha confermato che nessuna di queste sei molecole era stata precedentemente descritta nella letteratura scientifica.
La metodologia sviluppata rappresenta un avanzamento significativo nelle tecniche di dereplicazione, termine che in chimica dei prodotti naturali indica il processo di identificazione rapida ed esclusione di composti già noti per concentrarsi su quelli nuovi. L'integrazione di tecniche complementari permette di superare i limiti intrinseci di ciascun metodo: la spettroscopia NMR fornisce informazioni strutturali dettagliate ma richiede quantità relativamente elevate di campione; la spettrometria di massa è estremamente sensibile ma fornisce informazioni strutturali meno complete; l'analisi delle reti molecolari consente di inferire relazioni strutturali anche per composti presenti in tracce minime.
Dal punto di vista farmacologico, i valori di IC₅₀ ottenuti sono particolarmente significativi. L'acarbosio, farmaco inibitore dell'α-glucosidasi approvato per il trattamento del diabete di tipo 2, presenta tipicamente valori di IC₅₀ superiori a quelli delle caffaldeidi nei saggi in vitro. Tuttavia, è importante sottolineare che l'attività in vitro non si traduce automaticamente in efficacia clinica: la biodisponibilità orale, la stabilità metabolica, la capacità di raggiungere il sito d'azione intestinale e l'assenza di effetti collaterali sono tutti fattori che devono essere valutati attraverso studi preclinici e clinici prima di poter parlare di applicazioni terapeutiche.
Il caffè rappresenta una delle bevande più consumate al mondo, con circa 2,25 miliardi di tazze consumate quotidianamente. Diversi studi epidemiologici hanno associato il consumo regolare di caffè a una riduzione del rischio di sviluppare diabete di tipo 2, con meccanismi d'azione ancora non completamente chiariti. Tradizionalmente, questa protezione è stata attribuita alla caffeina e agli acidi clorogenici, ma i risultati di questa ricerca suggeriscono che anche i diterpeni esterificati, presenti in concentrazioni variabili a seconda dei metodi di preparazione, potrebbero contribuire agli effetti metabolici benefici della bevanda. È importante notare che il contenuto di diterpeni nel caffè varia significativamente in base al metodo di preparazione: il caffè non filtrato (come l'espresso o il caffè preparato con la moka) ne contiene quantità maggiori rispetto al caffè filtrato.
Le prospettive future della ricerca includono la valutazione in vivo dell'attività biologica dei composti identificati, utilizzando modelli animali di diabete o sindrome metabolica. Sarà inoltre necessario determinare la farmacocinetica di queste molecole: quali concentrazioni raggiungono effettivamente l'intestino dopo l'ingestione di caffè, quanto vengono assorbite, come vengono metabolizzate e se mantengono la loro attività biologica dopo il metabolismo epatico. Studi di sicurezza tossicologica dovranno escludere potenziali effetti avversi a dosi ripetute. Solo dopo questa serie di valutazioni precliniche sarà possibile considerare eventuali trial clinici per verificare se il consumo di estratti arricchiti in caffaldeidi possa effettivamente contribuire al controllo glicemico in pazienti con prediabete o diabete di tipo 2.
Oltre alle implicazioni per lo sviluppo di alimenti funzionali a base di caffè, questo studio dimostra la potenza delle strategie analitiche integrate per scoprire molecole bioattive in matrici alimentari complesse. La stessa metodologia potrebbe essere applicata ad altri alimenti sottoposti a trasformazioni termiche che generano una vasta gamma di composti, come cacao tostato, cereali sottoposti a cottura o frutta secca. La riduzione dell'uso di solventi e l'automazione parziale del processo rendono l'approccio sostenibile e scalabile per screening su larga scala di fonti alimentari diverse, accelerando potenzialmente la scoperta di nuovi composti con applicazioni nutrizionali o farmaceutiche.
