La manipolazione precisa del genoma su larga scala rappresenta una delle sfide più complesse dell’ingegneria genetica moderna, paragonabile al tentativo di riscrivere interi capitoli di un libro senza alterarne il significato complessivo. Un team di ricercatori cinesi, guidato dalla professoressa GAO Caixia dell’Istituto di Genetica e Biologia dello Sviluppo dell’Accademia Cinese delle Scienze, ha ora superato questo ostacolo sviluppando due nuove tecnologie di editing genomico che permettono di modificare con estrema precisione sequenze di DNA comprese tra migliaia e milioni di basi. I risultati, pubblicati il 4 agosto sulla prestigiosa rivista Cell, aprono scenari inediti per l’ingegneria genetica applicata alle piante superiori e ad altri organismi complessi.
Le limitazioni storiche del sistema Cre-Lox
Per comprendere la portata di questa innovazione, è utile ripercorrere le difficoltà che hanno storicamente limitato l’uso su larga scala del sistema Cre-Lox, uno strumento di ricombinazione sito-specifica ampiamente studiato per la sua capacità di manipolare i cromosomi con precisione. Nonostante le sue potenzialità, il sistema presentava tre problemi fondamentali. Le reazioni di ricombinazione reversibile, causate dalla simmetria intrinseca dei siti Lox, potevano annullare le modifiche introdotte, rendendo i risultati finali imprevedibili.
Inoltre, la natura tetramerica della ricombinasi Cre complicava l’ingegnerizzazione dell’enzima, ostacolandone l’ottimizzazione. Infine, i siti Lox residui lasciati dopo la ricombinazione compromettevano la precisione dell’editing, lasciando nel genoma modificato “cicatrici” genetiche indesiderate.
L'approccio innovativo: tre soluzioni integrate
I ricercatori hanno affrontato ciascuna di queste sfide con approcci completamente nuovi. Per risolvere il problema delle reazioni reversibili, hanno realizzato una piattaforma ad alto throughput per modificare rapidamente i siti di ricombinazione, progettando siti Lox asimmetrici. Questa innovazione ha portato alla creazione di nuove varianti in grado di ridurre di oltre 10 volte la ricombinazione inversa, mantenendo un’elevata efficienza in quella direzionale.
Per migliorare l’attività della ricombinasi Cre, il team ha impiegato AiCE (AI-informed Constraints for protein Engineering), un sistema guidato dall’intelligenza artificiale che integra modelli di ripiegamento proteico inverso con vincoli strutturali ed evolutivi. Ne è nato AiCErec, un metodo per ingegnerizzare ricombinasi con un’efficienza di ricombinazione 3,5 volte superiore rispetto alla versione naturale dell’enzima.
La strategia di editing "scarless"
Il terzo pilastro dell’innovazione riguarda lo sviluppo di una strategia di editing senza cicatrici. Sfruttando l’alta efficienza dei prime editor, i ricercatori hanno ideato Re-pegRNA, una tecnica che impiega RNA guida progettati per eseguire un re-prime editing sui siti Lox residui. Questo metodo sostituisce con precisione i siti rimanenti con la sequenza genomica originale, ottenendo modifiche completamente seamless.
L’integrazione di queste tre soluzioni ha portato alla creazione di due piattaforme programmabili, chiamate PCE e RePCE. Questi sistemi consentono di definire in modo flessibile posizione e orientamento dei siti Lox, permettendo l’editing preciso e senza cicatrici di frammenti di DNA da pochi kilobasi fino a interi megabasi, sia in cellule vegetali che animali.
Risultati straordinari e applicazioni pratiche
I risultati ottenuti sono notevoli per portata e precisione: il sistema è stato in grado di effettuare integrazioni mirate di frammenti fino a 18,8 kb, sostituzioni complete di 5 kb, inversioni cromosomiche su 12 Mb, delezioni di 4 Mb e persino traslocazioni di interi cromosomi. Come prova di applicazione pratica, i ricercatori hanno usato questa tecnologia per creare germoplasma di riso resistente agli erbicidi mediante un’inversione precisa di 315 kb, dimostrando le enormi potenzialità per il miglioramento genetico delle colture.
Questo lavoro pionieristico non solo supera le storiche limitazioni del sistema Cre-Lox, ma apre anche nuove strade all’ingegneria genomica avanzata in una vasta gamma di organismi, con l’obiettivo di accelerare lo sviluppo di varietà vegetali migliorate e applicazioni biotecnologiche all’avanguardia.